独立行政法人 産業技術総合研究所【理事長 中鉢 良治】（以下「産総研」という）ナノチューブ応用研究センター 高度機能CNTチーム 都 英次郎 主任研究員は、フランス国立科学研究センター【センター長 アラン フックス】（以下「CNRS」という）アルベルト ビアンコ 第一級研究ディレクター、ストラスブール大学【学長 アラン ベレッツ】ルイーザ デコラ 教授、国立大学法人 東北大学【総長 里見 進】八尾 寛 教授と共同で、生体透過性の高い近赤外レーザーにより熱と活性酸素種を発生する有機色素とカーボンナノホーン（CNH）からなる分子複合体（ナノモジュレーター）を作製し、この分子複合体を用いて生きた細胞の機能を操作できる新たな光制御技術を開発した。
今回開発したナノモジュレーターはCNH 表面に近赤外蛍光色素（IRDye800CW）を結合させたもので、水溶液中に分散させ、生体透過性の高い近赤外レーザー光を照射すると、熱と活性酸素種を効果的に発生する。この熱・活性酸素種発生システムにより、細胞へのカルシウムイオン流入や細胞膜に流れる電流を遠隔制御でき、生体深部における一つの細胞の機能制御技術が実現できる。また、脳疾患の分子・細胞レベルでの病態メカニズムの解明や新たな治療法を開発するためのツールとして期待される。
なお、この研究の詳細は、ドイツ化学誌Angewandte Chemie International Editionに2014年10月25日（日本時間）オンライン掲載される。
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(a)近赤外レーザー光で熱と活性酸素種を同時に発生するナノモジュレーターの概念図
(b)ナノモジュレーターによってカルシウム流入が起こり蛍光を発する神経細胞 |
近年の細胞研究の発展はめざましく、特にオプトジェネティクスを代表とする光を活用した細胞機能制御技術に注目が集まっている。オプトジェネティクスを用いると、光のスイッチを切り換えるだけで細胞同士の接続や特定の細胞集団の機能を操作できるため、未知の細胞ネットワークを解き明かし、病気の治療にも役立つと期待されている。しかし、基本的に、紫外光や可視光などの生体透過性の低い光を用いるため、生体深部にある細胞の機能を制御できない。また、ウイルスを用いて遺伝子改変を行う必要があるため、医療への応用は難しいという課題がある。
産総研では、近赤外レーザー光により容易に発熱するナノカーボン材料の特性（光発熱特性）に注目し、これまでに、体の中で発電できる光熱発電素子（2011年10月27日 産総研プレス発表）、生体内で標的とする生理活性物質を生み出す遺伝子発現制御技術（2012年4月24日 産総研プレス発表）、生体機能を模倣した新しい分子伝送システム（ナノ電車）（2012年11月28日 産総研プレス発表）などを開発している。今回、CNH表面に有機蛍光色素を化学的に修飾し、細胞機能を制御できる新しいナノモジュレーターの開発に取り組んだ。
今回の研究開発は、独立行政法人 日本学術振興会の科学研究費補助金「若手研究(A) (平成25～27年度)」、公益財団法人 新世代研究所の2014年度研究助成、CNRSによる支援を受けて行った。
CNHは生体透過性の高い近赤外の波長領域(700～1100 nm)のレーザー光により容易に発熱する。今回開発したナノモジュレーターは、CNH表面に水溶性の近赤外蛍光色素（IRDye800CW）と水溶性のジアミノトリエチレングリコールを化学修飾してある。図1に、合成したナノモジュレーターの水中への分散性と光発熱特性の評価結果を示す。CNHは水などに分散させようとしても、そのままでは分子間の強い相互作用により、粒状に凝集してしまう。CNHの光発熱特性を最大限に発揮させるには、CNHを凝集させずに水などにナノレベルで分散させる必要があるが、表面の水溶性分子により、今回開発したナノモジュレーターの水中での分散安定性は高く、凝集物の形成は観察されなかった（図1a）。また、IRDye800CWとジアミノトリエチレングリコールの両方を化学修飾したCNH（Dye-CNH）分散液、ジアミノトリエチレングリコールだけを化学修飾したCNH（NH2-CNH）分散溶液、IRDye800CWだけの溶液、細胞培養液のそれぞれに波長800 nmのレーザー光を照射したところ、Dye-CNH分散液で最大の温度上昇が見られた（図1b）。NH2-CNH分散液では温度上昇するもののDye-CNHよりも小さかった。一方、IRDye800CWだけの溶液、細胞培養液では、温度はほとんど上昇しなかった。Dye-CNH分散液が最大の温度上昇を示したのは、CNHの水中分散性、光発熱特性、近赤外光を吸収したIRDye800CWからCNHへのエネルギー移動や電子移動に伴う光発熱特性の増強効果によると考えられる。
一方、IRDye800CWなどの多くの近赤外蛍光色素は、近赤外光を照射すると活性酸素種を発生することが知られている。Dye-CNH分散液に、活性酸素種が存在すると緑色の蛍光を発する色素を溶解させ、近赤外レーザーを照射したところ蛍光顕微鏡により緑色蛍光が観察できた（図1c）。さらに、Dye-CNH分散液に加えてNH2-CNH分散液、IRDye800CWだけの溶液、蒸留水のそれぞれに蛍光色素を溶解させ、レーザー照射して蛍光顕微鏡により蛍光強度を測定したところ、Dye-CNH分散液とIRDye800CW溶液にだけレーザー出力に応じた強度の緑色蛍光が観察された（図1d）。これらは、今回開発したナノモジュレーター、Dye-CNHは、近赤外レーザー光によって効果的に熱と活性酸素種を発生することを示している。活性酸素種は、細胞内外へのイオンの出し入れに関わるタンパク質の活性を制御することで、ストレス、ホルモン伝達、免疫応答といった生命活動に欠かせないプロセスに関与しているため、ナノモジュレーターによる細胞機能制御が期待される。
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図1 ナノモジュレーターの(a)水中分散性、(b)光発熱特性、(c,d)活性酸素種発生特性 |
今回開発したナノモジュレーターを用いて、細胞内へのカルシウムイオンの流入挙動を観測するため、マウス神経芽細胞腫とラット神経のハイブリッド細胞（ND7/23）、マウスマクロファージ（RAW264.7）、ヒト子宮頚部癌細胞（HeLa）に、ナノモジュレーターを取り込ませた。細胞内には、カルシウムイオンと結合すると緑色蛍光を発する指示薬も入れてある。波長 808 nmの近赤外レーザー光を照射し、蛍光顕微鏡により観測したところ、3種類すべての細胞が効果的に蛍光を発光することから、ナノモジュレーターによりカルシウム流入が制御できることがわかった（図2a）。
また、ナノモジュレーターを細胞内に導入したラット脊髄後根神経節（DRG）に波長785 nmのレーザー光を照射し、パッチクランプ法によって細胞膜に流れる電流を測定したところ、レーザー出力に対応した電流の変化が見られ、ナノモジュレーターによる細胞膜の電流の制御の可能性も示された（図2b）。
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図2 (a)ナノモジュレーターによるRWA264.7細胞へのカルシウムイオン流入（図中の赤丸はレーザー照射位置）と(b)各レーザー出力に対応したDRG細胞の細胞膜に流れる電流の変化 |
今回開発した技術では、生体透過性の高い近赤外光を利用するため、従来は不可能であった生体深部の細胞機能制御が可能と考えられる。また、ウイルスを用いた遺伝子操作を必要としない。これらの利点は、例えば、ワイヤレス、ウイルスフリーで脳深部の特定領域の細胞を活性化させるなど、光を用いた細胞機能制御技術の性能を向上でき、さらに医療応用の可能性も高める。
今後は、この技術を応用して、単一の細胞レベルでの細胞機能解析技術を構築していく予定である。また、パーキンソン病やアルツハイマー病などの脳疾患に関わる新しい治療法につながる周辺コア技術の開発にも取り組む。