国立研究開発法人 産業技術総合研究所【理事長 中鉢 良治】（以下「産総研」という）環境管理研究部門【研究部門長 尾形 敦】環境微生物研究グループ 佐藤 由也 主任研究員、堀 知行 主任研究員、羽部 浩 研究グループ長、生物プロセス研究部門【研究部門長 鈴木 馨】バイオデザイン研究グループ 小池 英明 研究グループ付らは、廃水中の重油分解において、複雑な水処理微生物群（活性汚泥）の中で存在量がわずか0.25 %未満の硝化細菌が活性汚泥全体の重油分解性能を左右することを見いだした。
活性汚泥は世界中で100年以上利用されてきた最も身近で重要なバイオテクノロジーだが、数千種以上で構成される複雑な微生物群であるため、その水処理メカニズムは謎が多く、今なお原因不明のトラブルが尽きない。今回、産総研は遺伝子の多様性を評価する新しい手法とメタトランスクリプトーム解析を組み合わせ、廃水処理を行う活性汚泥リアクターに適用することで、多種類の微生物が介在する複雑な代謝経路から重油分解の鍵となる反応を抽出した。その結果、水処理システム全体の重油分解の性能を左右しているのは重油分解菌そのものではなく、重油分解菌にエネルギー源を供給する存在量がごくわずかの硝化細菌であることを見いだした。今後、今回の解析手法を応用して、水処理システム以外のさまざまな環境においても微生物反応の解明が期待される。
なお、この成果は、2019年5月13日（英国時間）に英国の学術誌Communications Biology (Nature Research)にオンライン掲載される。
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活性汚泥による廃水中の重油分解反応 |
活性汚泥は世界中で100年以上廃水処理に使われてきた重要なバイオテクノロジーである。例えば国内の生活廃水はほぼ全てが活性汚泥によって処理されるほか、産業廃水の多くも同技術で処理されており、現代社会に不可欠なインフラの一端を担っている。一方で、数千種以上の微生物で構成される活性汚泥はその複雑さ故に水処理反応メカニズムについて未解明の部分が大きく、予期せぬトラブルも尽きない。例えば、生物難分解性の重油はしばしば廃水に混入するが、低濃度でも活性汚泥の微生物活性を阻害する。このようなトラブルはこれまで、プロセス管理者の経験に頼って解決されてきたが、廃水処理にかけられる莫大（ばくだい）なエネルギーコスト（例えば下水処理は国内年間消費電力量の約0.7 %を消費）を考えると運転の高効率化は急務であり、根本的な問題把握が必要とされている。
産総研では、2012年に開始した水資源の安全確保と有効利用に関する研究プロジェクト（AIST水プロジェクト：https://unit.aist.go.jp/emri/water/）の中で微生物学的知見に基づいた水処理再生プロセスの高活性維持管理技術に関わる研究を行ってきた。これまで重油が廃水に混入すると活性汚泥の微生物活性が阻害される現象について、いくつかの重油分解菌の知見はあったが、自然環境中など複合的な微生物群による重油分解の機構や、重油が水処理活性を阻害する詳細な機構は未解明であり、これらについての研究を進めてきた。
また、活性汚泥の適切な診断方法、特に個々の微生物の代謝レベルでの挙動の診断方法は確立されていなかった。産総研では微生物遺伝子の多様性を評価するメタトランスクリプトーム解析法を確立してきたが、今回、この手法を重油含有廃水の処理に用いられる実際の活性汚泥に適用し、詳細な機構の解明に取り組んだ。
なお、本研究の一部は、独立行政法人 日本学術振興会の科学研究費助成事業による支援を受けて行った。
活性汚泥を用いた水処理プロセスでは、同じ条件での運転でも、しばしば全く異なる結果が得られることがある。今回、パイロットスケールの活性汚泥リアクターを用いて重油含有廃水の処理実験を行った。ニつのリアクターに同じ活性汚泥を加え、重油の濃度を段階的に上げながら添加したところ、同じ条件での運転にもかかわらず、リアクターの処理能に大きな差が生じていた（図1）。
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図1 二つの活性汚泥リアクターの処理能の変化 |
遺伝子情報から酵素などのタンパク質を生産することを遺伝子発現というが、微生物は環境変化に対応するために、必要な酵素を必要な量だけ発現して目的の化学反応を進めている。発現している遺伝子の種類と量を調べて、その環境で微生物が行っている反応を知ることをトランスクリプトーム解析という。今回、処理能の差が生じた原因解明のため、活性汚泥中の各種微生物を対象にトランスクリプトーム解析を行った。
従来トランスクリプトーム解析では、図2（左）に示すように「発現量の高い遺伝子ほど重要」という優先順位で遺伝子を評価してきた。しかしこの方法では、例えば、微生物の成長に関する遺伝子など、多くの微生物に共通する遺伝子が検出されやすく、個々の微生物の環境や状況を反映した遺伝子が検出されることはまれであった。そこで、ある特定の遺伝子をその環境で使う微生物種の数で評価する手法を考案した（図2（右））。これにより、莫大な遺伝子データからその環境で特に重要な遺伝子を抽出できる。今回、本手法を用いて活性汚泥リアクターの重油分解経路の解析を行った。
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図2 遺伝子の多様性に着目した新しい評価手法 |
一般に重油は、空気中などの酸素共存下で酸化されながら分解される。しかし、今回の活性汚泥リアクターの解析から、処理能力に差が生じた二つのリアクターのどちらでも、常に酸素が供給されていたにもかかわらず、酸素を使わない嫌気的な分解反応が主要であることがわかった。ところが、嫌気的な条件下で働く重油分解菌の遺伝子発現量は二つのリアクターで大差なく、処理能には重油分解菌以外の要因の影響が大きいことが示唆された。
微生物もヒトと同様に酸素を使った呼吸でエネルギーを獲得するものが多いが、今回検出された重油分解菌のほとんどは、従来知られる重油分解菌と異なり、硝酸を使った呼吸でもエネルギーを獲得できる種であった。今回の実験では外部から硝酸を供給しなかったが、図3（左）に示すように、有機物を含む廃水の処理過程でアンモニアが蓄積され、活性汚泥に含まれる硝化細菌が蓄積されたアンモニアから硝酸を生成し、重油分解菌はその硝酸を使ってエネルギーを獲得したと考えられる。今回の解析から二つのリアクターでは、硝化細菌の活性が大きく異なっていたことが分かった。高処理能のリアクターでは硝化細菌の活性が高かったため（図3（右））、重油分解菌のエネルギー源である硝酸が十分に供給され、重油分解反応が促進されていた。また、重油には多くの微生物の活性を阻害する芳香族化合物が含まれるが、重油分解菌が芳香族化合物も分解するので、硝化細菌の活性が阻害されずにすむという、重油分解菌と硝化細菌の間には間接的な協力関係があると考えられる。一方、硝化細菌の活性が低いリアクターでは硝酸の供給が十分でなかったため重油分解反応が進みにくかったと考えられる。
今回用いたリアクターの活性汚泥中の細菌の存在量を調べたところ、重油分解菌の存在量は全体の40 %にも上る一方で、そのエネルギー源の硝酸を供給する硝化細菌の存在量は0.25 %未満と極めて少なかった。従来は存在量の多い微生物ほど重要とされることが多かったが、本手法によって存在量がごくわずかな微生物が重要な働きをすることを示すことができた。また、従来はある環境にどのような微生物がいるかは分かっても、それらが実際に何をしているかは分からなかった。しかし今回の手法を用いることにより、酸素が存在する環境であっても、実際には微生物は嫌気的に重油を分解していることが明らかになった。近年、従来は酸素を使った分解が主流と考えられてきた難分解性化合物の微生物分解が、自然環境中では嫌気的に分解されることもあるという事例が報告されている。今回の結果もそれらを支持するものであり、今後より詳細に自然環境中で起きている分解反応が解明されていくことが期待される。
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図3 硝化細菌の活性の比較と硝酸供給による重油分解の促進 |
現在、実際の水処理システムで問題となっているさまざまな現象を対象に、今回用いたメタトランスクリプトーム解析を進めており、微生物学的見地から水処理プロセスを高効率化することを目指している。また、本手法は多くの環境サンプルに適用できるので、今後は、微生物は介在するが因果関係がわからない多様な環境問題を解決するため、解析の適用範囲を広げる予定である。