独立行政法人 産業技術総合研究所【理事長 野間口 有】（以下「産総研」という）生物機能工学研究部門【部門長 織田 雅直】バイオメジャー研究グループ【研究グループ長 関口 勇地】 野田 尚宏 研究員は、早稲田大学【総長 白井 克彦】理工学術院 常田 聡 教授、谷 英典 博士研究員、株式会社 J-Bio21【代表取締役 児玉 俊史】市川 康平 研究員らとともに、低コストで汎用性・機動性に優れた遺伝子（DNA）の定量方法を開発した。
インフルエンザのようなウイルスや食品検査等、遺伝子（DNA）の定量技術は重要になっている。産総研は以前にDNAのG(グアニン)塩基が近づくと蛍光が消える蛍光色素を有する蛍光DNAプローブを開発した。蛍光DNAプローブが標的DNAと結合すると蛍光が消えるので、蛍光消光を観測することによりDNA量が定量できる。この場合、蛍光DNAプローブは異なる標的DNA配列ごとに合成する必要があり、合成に時間とコストがかかった。
今回、標的DNAと蛍光DNAプローブの両者に結合して、両者を結びつけるジョイントDNA鎖を用いることによってこの問題を解決した。ジョイントDNAは標的DNAごとに設計・合成する必要はあるが、蛍光色素を結合しないため、合成時間とコストが大幅に節約できる。これによってさまざまな遺伝子（DNA）配列に対して、1種類の蛍光DNAプローブで定量が可能である（図1）。蛍光DNAプローブは予め大量に合成し、保存しておくことができるため、省コスト化と機動性を実現できる。
本技術の詳細は米国化学会Analytical Chemistry誌電子版に掲載された。
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図1 ジョイントDNAは蛍光DNAプローブと標的遺伝子（DNA）を結びつける |
遺伝子を定量する技術は、ヒトの病気診断等を目的とした遺伝子発現解析、新型インフルエンザやC型肝炎ウイルスの検出・定量あるいは、遺伝子組み換え食品の混入率検査等に利用されており、社会的必要性の高い技術である。
これまで、微生物や動植物に含まれる遺伝子の定量にはリアルタイムPCR（Polymerase Chain Reaction）法が用いられてきた。中でも、標的遺伝子のDNA配列に特異的に結合する蛍光DNAプローブを利用した検出技術は、定量の精度が高いことから遺伝子の定量技術として広く採用されている。しかしながら、標的遺伝子ごとに異なる蛍光プローブを設計・合成する必要があるため、複数の標的遺伝子を定量するには、コストがかかる、機動性がないといった問題点があった。
機動性・コストパフォーマンスに優れた遺伝子定量技術の開発が望まれていた。それによりライフサイエンスだけではなく、環境・農業・食品分野等さまざまな分野へ遺伝子定量技術が広がるものと期待される。
産総研は簡便・低コスト・高速・正確な遺伝子定量技術の開発を推進している。これまで産総研生物機能工学研究部門は、早稲田大学および株式会社J-Bio21とともに、DNAのグアニン塩基が近づくと蛍光が消光する蛍光色素を用いた蛍光DNAプローブを開発した。（2007年5月29日プレス発表）。
さらに、低コスト化を目指した研究開発を行ってきている。
これまでに標的DNAと結合し、DNAのグアニン塩基が近づくと蛍光が消光する蛍光色素で標識した蛍光DNAプローブを開発した。蛍光DNAプローブが標的DNAと結合すると蛍光が消光するので、蛍光消光を測定することによりDNAの量が定量できる。この場合、蛍光DNAプローブは異なる標的DNA配列ごとに合成する必要があり、合成時間とコストがかかった。
今回、標的DNAと蛍光DNAプローブの両者に結合するジョイントDNA鎖を用いることによってこの問題を解決した。ジョイントDNA鎖は5’側には標的DNAに相補的な配列、3’側には蛍光DNAプローブ に相補的な配列があり、両配列の間を塩基C（シトシン）－T（チミン）配列でつないである。ジョイントDNA鎖は標的DNAと蛍光DNAプローブの両方に結合し、蛍光DNAプローブが、標的DNAのG(グアニン)塩基に近づくと消光する。これまでと同様に蛍光消光の程度を測定することによって標的DNAの定量をすることができる。（図1）。今回開発した蛍光DNAプローブ はプローブDNA3’端のA(アデニン)塩基に蛍光色素を結合させている。このA塩基はジョイントDNA鎖内のC－T配列のTの向かいにきて、となりのC塩基の向かいには標的DNAのG塩基がくるので、G塩基が蛍光色素のそばに来て蛍光消光するように設計されている。
ジョイントDNAは標的DNAごとに設計・合成する必要はあるが、蛍光色素を結合しないため合成時間とコストが大幅に節約できる。これによって対象の遺伝子が異なった配列であっても、1種類の蛍光DNAプローブで定量が可能である。コスト的には従来の蛍光プローブ法と比べて1/5から1/10程度に抑えることが可能となる。
本技術では、測定しようとする標的遺伝子と蛍光DNAプローブ 、ジョイントDNAを用いたリアルタイムPCR法により標的遺伝子の定量を行う。PCRのサイクル進行によって標的遺伝子量は増大し、それに比例して蛍光強度は減少（蛍光が消光）してゆくので、その値をグラフ化することによって、対象の遺伝子を定量することができる（図2）。
本技術を用いてヒトの遺伝子であるß-アクチン、 アルブミン、 ß-グロビンの3種類を定量した結果、本技術は1種類の蛍光プローブでこれら3種類の遺伝子をコピー数わずか10コピーから108コピーという高コピー数の広い範囲で定量できた。
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図２ 新技術による遺伝子定量の概要 |
ヒトの病気診断等を目的とした遺伝子発現解析や、ウイルス等の定量的検出も可能となるよう本技術の応用を進める。